化學(xué)發(fā)光試劑科學(xué)理論發(fā)展觀,核心講解.原理:辣根過氧化酶使試劑中的發(fā)光物(Luminol)氧化并發(fā)光,而試劑中含有增強劑這使得發(fā)光增強了1000倍。在免疫印跡中,將復(fù)雜的蛋白混合物經(jīng)SDS-PAGE分離,并轉(zhuǎn)移到固相膜上(如NC、PVDF)等,用于免疫學(xué)檢測,經(jīng)HRP標(biāo)記的抗體與膜上的蛋白直接(標(biāo)記一抗)或間接(標(biāo)記二抗)反應(yīng)。當(dāng)加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑后,Luminol發(fā)生氧化降解,并發(fā)射波長為428nm的光,此光可經(jīng)X光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來。
化學(xué)發(fā)光試劑使用方法,印跡膜制備,按常規(guī)方法完成SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)膜操作,適當(dāng)?shù)姆忾]非常重要??梢酝ㄟ^標(biāo)記一抗或二抗的手段引入HRP,一般采用市售的HRP二抗交聯(lián)物。仔細(xì)地淋洗對于降低背景非常重要,在與HRP交聯(lián)物溫育后,膜片更需仔細(xì)洗滌,所有步驟均在室溫下完成。
化學(xué)發(fā)光試劑的配置,在使用前等量混合A液和B液,混合后盡快使用。將膜片置混合液中于室溫下振蕩溫育2分鐘,每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片。蛋白信號顯現(xiàn),用平頭鑷鉗住膜片,垂直置于吸水紙以吸去過量試劑。置膜片于二層保鮮膜之間,小心趕盡氣泡。將膜片吸附蛋白面朝上,置于X光片盒中。于暗室中壓上X光片。根據(jù)信號的強弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間,一般為1min或5min,也可選擇不同時間多次壓片,以達(dá)*效果.創(chuàng)造奇跡,更好未來.